導言：基質輔助激光解吸電離質譜成(chéng)像技術（MALDI-MSI）發(fā)展至今，受到國(guó)際及國(guó)内衆多專家學(xué)者的關注與認可。該技術既能(néng)夠可視化呈現目标化合物在組織和細胞中的二維離子密度圖，還(hái)能(néng)夠同時(shí)呈現衆多其它化合物的組成(chéng)、相對(duì)豐度及空間分布情況，實現對(duì)生物樣(yàng)本的無标記、高通量檢測。自動聚焦3D AP-SMALDI質譜成(chéng)像技術的橫空出世爲非平面(miàn)生物樣(yàng)本的檢測提供了更爲高效和強有力的技術支撐，可直接用于植物葉片、花瓣等樣(yàng)本表面(miàn)化合物的可視化分析。自然界中，植物在整個生長(cháng)周期内會(huì)受到來自方方面(miàn)面(miàn)的威脅，如生物脅迫和非生物脅迫，其中生物脅迫包括植食性動物以及各種(zhǒng)病原微生物的侵害。爲了面(miàn)對(duì)植食性動物這(zhè)個宿敵，植物的防禦手段也可謂多種(zhǒng)多樣(yàng)，其中直接防禦措施就(jiù)是植物在被(bèi)取食時(shí)産生有毒的次生代謝産物以此傷害來侵害的植食性動物，影響其生長(cháng)發(fā)育。

        2021年2月5日，德國(guó)吉森大學(xué)Bernhard Spengler教授團隊在Analytical and Bioanalytical Chemistry上發(fā)表了名爲 “3D-surface MALDI mass spectrometry imaging for visualising plant defensive cardiac glycosides in Asclepias curassavica ”的文章，研究人員利用3D表面(miàn)MALDI-MSI技術，以馬利筋爲研究對(duì)象，對(duì)馬利筋苷等8種(zhǒng)強心苷類植物防禦性物質進(jìn)行了空間解析。結果表明，大量防禦相關代謝物分布于機械損傷(模拟草食動物攻擊) 馬利筋葉片(葉片表面(miàn)高度變化達700μm)的受損傷部位。本研究充分展示了自動聚焦AP-SMALDI質譜成(chéng)像技術的強大能(néng)力和潛在的适用性，能(néng)夠分析近生理狀态下植物樣(yàng)品的三維表面(miàn)化合物分布信息。

       在分析受損傷馬利筋葉片之前，作者利用3D AP-SMALDI質譜成(chéng)像技術分析了完整葉片上強心苷類防禦物質的空間分布。結果表明，在完整葉片中8種(zhǒng)強心苷類防禦性代謝物均分布在主脈内，即分布于無節乳汁管細胞所包含的高濃度乳汁中（圖1）。

       圖1（a）3D AP-SMALDI MSI檢測後(hòu)的馬利筋葉片光學(xué)顯微圖像。（b）葉片表面(miàn)激光燒蝕斑放大圖像。（c）完整馬利筋葉片3D光學(xué)顯微圖像，葉片表面(miàn)高度變化高達350μm(圖示藍色到紅色表示葉片表面(miàn)高度越來越高。d RG疊加的MSI圖像，馬利筋苷(m/z613.2410，[M+K]+，紅色)和二糖(m/z381.0793[M+H]+，綠色)。（e）從葉片葉脈區域獲得的質量範圍爲m/z420-620的單像素質譜圖。MSI圖像178×178pixels，空間分辨率45μm，比例尺a、c、d爲1mm、b爲150μm。

       随後(hòu)作者檢測了機械損傷1小時(shí)後(hòu)的馬利筋葉片，結果顯示，強心苷類防禦性代謝物均集中分布于受損部位（圖2）。由于在葉片受損10min後(hòu)其傷口處即可檢測到高濃度強心苷（圖3a-c），故用強心苷合成(chéng)增多來解釋這(zhè)一現象貌似并不合理。因此，本研究與以往研究一緻認爲乳汁是一種(zhǒng)可分配的防禦物質，即葉片受損傷後(hòu)乳汁在第一時(shí)間運輸至受傷部位，使得有毒防禦化合物在損傷部位迅速富集。

       圖2（a）3D AP-SMALDI MSI檢測後(hòu)的馬利筋葉片光學(xué)顯微圖像。（b）馬利筋葉片3D光學(xué)顯微圖像，損傷部位的高度差最高可達400μm。（c）RGB疊加MSI圖像，烏拉卡定(m/z569.2132，[M+K]+，紅色)、二糖(m/z365.1056，[M+Na]+，綠色)和三羟基黃酮丙二酰糖苷(m/z557.0692，[M+K]+，藍色)。（d） 烏拉卡定(m/z569.2132，[M+K]+)。（e）二糖(m/z365.1056，[M+Na]+)。（f）三羟基黃酮丙二酰糖苷單離子圖像(m/z557.0692，[M+K]+)。MSI圖像143×171 pixels，空間分辨率35μm，所有比例尺均爲1mm。

       進(jìn)一步作者考察了防禦代謝物不同時(shí)間點的積累速率，作者分别檢測了傷口間隔時(shí)間爲4h50min（即葉片受損傷5h和10min後(hòu)進(jìn)行檢測）和22h（即葉片受損傷24h和2h後(hòu)進(jìn)行檢測）的機械損傷葉片。結果顯示，間隔時(shí)間較短的兩(liǎng)個傷口處強心苷類物質的積累量相差不大，而間隔時(shí)間較長(cháng)的兩(liǎng)個傷口處則呈現出明顯的差異。葉片受損24小時(shí)後(hòu)，受損部位強心苷類物質明顯減少，表明該類物質随著(zhe)時(shí)間的延長(cháng)發(fā)生了轉移或降解（圖3）。

       圖3（a,d）AP-SMALDI MSI檢測後(hòu)葉片3D光學(xué)顯微圖像，對(duì)受傷區域進(jìn)行标記，并标出相關的時(shí)間間隔。（b,e）3D顯微圖像，葉片表面(miàn)高度差分别達500μm和600μm。（c,f）RGB疊加MSI圖像calotoxin(m/z587.2250，[M+K]+，紅色)，二羟基黃酮(m/z255.0652，[M+H]+，綠色)和m/z255.2110(藍色) MSI圖像c111×111 pixels，空間分辨率45μm，f112×103 pixels，空間分辨率35μm，比例尺爲1mm。

       植物有防禦手段，動物亦有捕食策略。許多植食性昆蟲通過(guò)脈切的方式來阻止植物防禦。例如，捕食時(shí)昆蟲先切斷葉脈上端，使防禦物質不能(néng)再轉移并積累在下遊部位。因此，作者采用3D AP-SMALDI MSI技術對(duì)脈切葉片的近心端（切口上遊）及遠心端（切口下遊）傷口進(jìn)行檢測，發(fā)現遠心端比近心端防禦性代謝物積累明顯減少，說(shuō)明脈切影響像Uscharin這(zhè)類的防禦性物質的轉移使其不能(néng)到達下遊葉片發(fā)揮其防禦作用，揭示了爲什麼(me)大多數含有乳汁的植物(如馬利筋)的專門捕食者在取食葉片時(shí)采用脈切作爲一種(zhǒng)預防中毒的策略。

       圖4（a）AP-SMALDI MSI檢測前葉片表面(miàn)的光學(xué)顯微圖像，葉片表面(miàn)滲出乳汁的區域被(bèi)紅線标記出來。（b）葉片3D光學(xué)顯微圖像，高度差高達700μm。（c, d）RGB疊加MSI圖像Uscharin(m/z626.2189，[M+K]+，紅色)，（d）脫鎂葉綠素a(m/z909.5291，[M+K]+，紅色)。m/z771.4869(藍色)和丙二酰染料木甙(m/z557.0692，[M+K]+，綠色)是目标化合物c、d的背景信号。MSI圖像157×171pixels，空間分辨率40μm，比例尺爲1mm。

       結論：本文采用自動聚焦3D AP-SMALDI MSI技術對(duì)馬利筋葉片中防禦性代謝物進(jìn)行了精确定位，表明乳汁是植物抵禦組織損傷和潛在植食性昆蟲攻擊的化學(xué)防禦機制的一部分，植物葉片受損後(hòu)，乳汁流向(xiàng)傷口的速度增加，使得防禦物質在葉片受損部位積累, 并進(jìn)一步分析了這(zhè)種(zhǒng)積累速率在時(shí)間和空間上的變化。此外，研究人員模仿昆蟲的捕食策略（脈切）來抵禦這(zhè)種(zhǒng)防禦機制，觀察到在切割傷口的遠端有較少的有毒代謝物積累。同時(shí)，大量未識别的離子信号顯示出與強心苷類物質具有相同的空間分布，表明馬利筋中存在著(zhe)多種(zhǒng)多樣(yàng)的防禦性物質。因此，在MALDI 質譜成(chéng)像的背景下，以HPLC-MS作爲補充方法的非靶向(xiàng)代謝組學(xué)是發(fā)現和研究植物與草食性昆蟲和病原菌相互作用關系的絕佳方法，與此同時(shí)，組織原位MALDI MS/MS檢測同樣(yàng)有助于對(duì)未知代謝物的鑒定。